課程42
中藥材（飲片）鑒別及質(zhì)量控制
中藥材（飲片）質(zhì)量控制的目標(biāo)
1.全面提高和完善中藥材（包括民族藥）、中藥飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，重點(diǎn)研究道地藥材與非道地藥材、野生與栽培藥材品質(zhì)的特異性和常用中藥材專屬性檢測(cè)方法，深入研究并建立能有效控制中藥材及中藥飲片質(zhì)量的方法。
2.建立符合中醫(yī)藥特點(diǎn)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，逐步由單一指標(biāo)性成分定性定量向活性、有效成分及生物測(cè)定的綜合檢測(cè)過渡，向多成分及和指紋或特征圖譜整體質(zhì)量控制模式轉(zhuǎn)化。
3.重點(diǎn)增加和完善中藥安全性檢測(cè)方法；增強(qiáng)檢測(cè)方法的專屬性；建立科學(xué)合理的控制指標(biāo)。
    一、標(biāo)準(zhǔn)制定的原則與技術(shù)要求
    中藥特點(diǎn)：功能主治廣泛，物質(zhì)基礎(chǔ)復(fù)雜，易于摻雜、造假，質(zhì)量控制難度大。
因此，中藥質(zhì)量控制是藥品質(zhì)量控制的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。
中藥材、飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)，也是確保臨床湯劑和中成藥質(zhì)量的關(guān)鍵。
中藥化學(xué)成分研究的現(xiàn)狀
1.對(duì)中藥化學(xué)成分、特別是有效成分的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，對(duì)很多中藥藥效物質(zhì)的了解只是一知半解：如人參、地黃。
   2.化學(xué)成分與功效不相關(guān)，或相關(guān)性不大；如板藍(lán)根、蟲草
   3.專屬性不強(qiáng)，如綠原酸、槲皮素、熊果酸、氨基酸 
   4.指標(biāo)成分含量很低，難以代表中藥的整體療效：1%,        0.1%, 0.01%,
   5.量效關(guān)系不清楚 
   6.完全未知或基本不清楚
中藥材（飲片）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立的基本要素
    科學(xué)性
    分析、檢定方法達(dá)到辨別真?zhèn)巍⒃u(píng)價(jià)優(yōu)劣的目的
    指標(biāo)成分的有無或含量高低能夠反映分析對(duì)象藥物的內(nèi)在品質(zhì)
    測(cè)定值最大限度地接近真值
    先進(jìn)性
    反映藥物研究的最新進(jìn)展（各國(guó)藥典, 最新的文獻(xiàn)）
    儀器設(shè)備自動(dòng)化程度高
    適用性
    簡(jiǎn)便
    快速
    經(jīng)濟(jì)
安全
普及
中藥材（飲片）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基本內(nèi)容
 中藥材、飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基本內(nèi)容：
名稱
來源
性狀
鑒別
檢查
含量測(cè)定
炮制
性味與歸經(jīng)
功能與主治
用法與用量
注意
貯藏
樣品的收集
    考證來源、產(chǎn)地、資源情況
收集代表性樣品
對(duì)于容易區(qū)分的多來源品種，每種來源都要收集3～5批樣品，單來源的品種至少應(yīng)收集10批以上
避免由同一供貨渠道收集實(shí)際為一批樣品的“多批樣品”
注意收集該品種的易混偽品供比較研究用
收集的藥材樣品應(yīng)標(biāo)明產(chǎn)地、收集地、收集時(shí)間等。
新增藥材品種要求附帶2份臘葉標(biāo)本，臘葉標(biāo)本須經(jīng)相關(guān)專家簽名鑒定
取樣
 一般性了解：藥材的品名、產(chǎn)地、批號(hào)、規(guī)格等級(jí)以及包件式樣是否符合要求。
 一般性檢查：包件的完整性、清潔程度、有無水跡、霉?fàn)€或污染等異常情況，發(fā)現(xiàn)有腐敗、霉壞、嚴(yán)重蟲蛀情況或色、嗅、味顯著異常的藥材應(yīng)另行取樣。
 一般取樣方法：5件以下，逐件取樣；5～99件，抽5件；100～1000件，抽5％；超過1000件部分，再抽1％；
貴重藥材：逐件抽樣。
破碎、粉末藥材：在2～3個(gè)不同部位取樣。
 取樣量：一般藥材100～500g；粉末藥材：25～50g；貴重藥材：5～10g；個(gè)體重量較大的藥材：適當(dāng)增加取樣量。
最終取樣量必須大于全檢需要量的3倍。
中藥材（飲片）命名
1. 中藥材的名稱與命名原則
包括中文名、漢語拼音及拉丁名。
歷代本草
中藥大辭典
中華本草
地方藥材標(biāo)準(zhǔn)
地方草藥匯編
中國(guó)植物志
地方植物志
2. 炮制品的名稱與命名原則
炮制品的名稱應(yīng)與藥材名稱相呼應(yīng)，如炙黃芪、蜜麻黃、熟地黃。
中藥材來源包含的內(nèi)容
植動(dòng)物藥材：原植(動(dòng))物的科名、植(動(dòng))物的中文名、拉丁學(xué)名、藥用部位、采收季節(jié)、產(chǎn)地加工和藥材傳統(tǒng)名稱；
礦物藥：礦物的類、族、礦石名或巖石名、主要成分及產(chǎn)地加工。
參考依據(jù)：
Flora of China
中國(guó)高等植物
中國(guó)植物志
地方植物志
新編中藥志
常用中藥材品種整理和質(zhì)量研究
《中國(guó)藥典》中部分拉丁學(xué)名已被調(diào)整，被調(diào)整的拉丁學(xué)名可作為異名標(biāo)示，如祁州漏蘆Stemmacantha uniflora Dittrich （Rhaponticum uniflorum (L.) DC.）。
此類調(diào)整必須慎重，《中國(guó)藥典》須保持相對(duì)的穩(wěn)定，允許相對(duì)滯后。對(duì)于非公認(rèn)的較新的過細(xì)的分類研究結(jié)果不宜急于跟進(jìn)、盲目采用。
1. 基原(Origin)的確定
本草考證
產(chǎn)地調(diào)查與基原鑒定
市場(chǎng)調(diào)查
丁公藤注射劑原料藥材的鑒定研究
《中國(guó)藥典》（2005年版 一部）：丁公藤為旋花科植物丁公藤Erycibe obtusifolia Benth.及光葉丁公藤E. schmidtii Craib的藤莖。
  現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)：東莨菪內(nèi)酯定性、定量分析，無法區(qū)分正品、偽品。
2.采收時(shí)間
采收時(shí)間如必須控制在某生長(zhǎng)階段的，則應(yīng)明確規(guī)定，如“花盛開時(shí)采收”、“枝葉茂盛時(shí)采收”。
有的品種對(duì)采收時(shí)間段雖不十分敏感，但某生長(zhǎng)階段的采收質(zhì)量相對(duì)較好，則可規(guī)定為“全年均可采收，以枝葉茂盛時(shí)采收為佳”等。
道地藥材的采收時(shí)間較為明確，應(yīng)盡量清楚記述，如藥材白芷：“川白芷6月，禹白芷8月，祁白芷9月，--- 采挖”。
凡全年均可采收，對(duì)藥材質(zhì)量無影響者，規(guī)定為“全年均可采收”。
3.產(chǎn)地加工
主要規(guī)定藥材采收后進(jìn)行加工處理的基本要求。
有的藥材由于地區(qū)習(xí)慣不同，加工的方法不一，盡可能選擇能確保質(zhì)量具有代表性的一種方法，必要時(shí)也可列兩種方法。
如果是在產(chǎn)地加工成片(段)，應(yīng)在起草說明中明確。
加工處理應(yīng)重點(diǎn)注明以下方法，如“烤干”、“趁鮮切片后干燥”、“開水略燙后干燥”、“刮去外皮后干燥”等。
 性狀描述與檢驗(yàn)
1. 性狀鑒定與檢驗(yàn)的一般方法
“性狀”系指藥材和飲片的形狀、大小、色澤、表面、質(zhì)地、斷面(包括折斷面或切斷面)及氣味等特征。
按藥材、飲片的實(shí)際形態(tài)描述，描述要抓主要特征，文字要簡(jiǎn)練，用語要準(zhǔn)確。
觀察方法主要是運(yùn)用感官來鑒別，如用眼看(較細(xì)小的可借助于擴(kuò)大鏡或解剖鏡)、手摸、鼻聞、口嘗等方法。
多植(動(dòng))物來源的藥材，其性狀無明顯區(qū)別者，可合并描述；有明顯區(qū)別者，應(yīng)分別描述。
無論是根、根莖、藤莖、大果實(shí)、皮類藥材，應(yīng)盡量多描述斷面特征，以便進(jìn)行破碎藥材或飲片的性狀鑒別，也可避免飲片性狀的重復(fù)描述內(nèi)容。
         1. 形狀是指藥材和飲片的外形。觀察時(shí)一般不需預(yù)處理，如觀察很皺縮的全草、葉或花類時(shí)，可先浸濕使軟化后，展平，觀察。觀察某些果實(shí)、種子類時(shí)，如有必要可浸軟后，取下果皮或種皮，以觀察內(nèi)部特征。
描述用語以現(xiàn)代術(shù)語為主。對(duì)傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)中形容藥材特征的形象化詞匯，可結(jié)合現(xiàn)代術(shù)語描述，如海馬傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)的“馬頭蛇尾瓦楞身”，描述為“頭略似馬頭，……體上有瓦楞形的節(jié)紋……”。
 
  2. 大小是指藥材和飲片的長(zhǎng)短、粗細(xì)(直徑)和厚薄。一般應(yīng)測(cè)量較多的供試品，可允許有少量高于或低于規(guī)定的數(shù)值。超出或低于規(guī)定范圍樣品的數(shù)量占總量的比例不得過20%；超出和低于規(guī)定范圍樣品的數(shù)量之和占總量的比例不得過30%。測(cè)量時(shí)應(yīng)用毫米刻度尺。對(duì)細(xì)小的種子或果實(shí)類，可將每10粒種子緊密排成一行，以毫米刻度尺測(cè)量后求其平均值。
 
  3. 色澤是指在日光下觀察的藥材和飲片顏色及光澤度。如用兩種色調(diào)復(fù)合描述顏色時(shí)，以后一種色調(diào)為主。例如黃棕色，即以棕色為主。
  4. 觀察藥材或飲片表面特征、質(zhì)地和斷面特征時(shí)，供試品一般不作預(yù)處理。如折斷面不易觀察到紋理，可削平后進(jìn)行觀察。
 5. 檢查藥材或飲片氣味時(shí)，可直接嗅聞，或在折斷、破碎或搓揉時(shí)進(jìn)行。必要時(shí)可用熱水濕潤(rùn)后檢查。
  6. 檢查藥材或飲片味感時(shí)，可取少量直接口嘗，或加熱水浸泡后嘗浸出液。有毒藥材及飲片如需嘗味時(shí)，應(yīng)注意防止中毒。
  7. 藥材和飲片外觀不得有蟲蛀、發(fā)霉、其他物質(zhì)污染等異常現(xiàn)象。
特別注意中藥栽培品性狀的變化。
  如:黃芩【性狀】 本品呈圓錐形，扭曲，長(zhǎng)8～25cm，直徑1～3cm。表面棕黃色或深黃色，有稀疏的疣狀細(xì)根痕，上部較粗糙，有扭曲的縱皺或不規(guī)則的網(wǎng)紋，下部有順紋和細(xì)皺。質(zhì)硬而脆，易折斷，斷面黃色，中心紅棕色；老根中心呈枯朽狀或中空，暗棕色或棕黑色。氣微，味苦。
栽培品較細(xì)長(zhǎng)，多有分枝。表面淺黃棕色，外皮緊貼，縱皺紋較細(xì)膩。斷面黃色或淺黃色，略呈角質(zhì)樣。味微苦。
 例貓爪草：本品呈紡錘形，多5～6個(gè)簇生，形似貓爪，長(zhǎng)3～10mm，直徑2～3mm，頂端有黃褐色殘莖或莖痕。（2005年版）
 本品由數(shù)個(gè)至數(shù)十個(gè)紡錘形的塊根簇生，形似貓爪，（2010年版）
鑒別
      系指鑒別藥材、飲片真?zhèn)蔚姆椒ǎń?jīng)驗(yàn)鑒別、顯微鑒別、理化鑒別。
所建立的鑒別項(xiàng)目應(yīng)符合總則的要求，并應(yīng)盡可能區(qū)別同類相關(guān)品種或可能存在的易混淆品種。
對(duì)無專屬性、重現(xiàn)性差的項(xiàng)目，盡量不予收載。
 
鑒別常用的方法 1. 經(jīng)驗(yàn)鑒別：是用傳統(tǒng)的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，對(duì)藥材的某些特征，采用直觀方法進(jìn)行鑒別真?zhèn)蔚姆椒?。?yīng)先描述試驗(yàn)的方法，再描述試驗(yàn)產(chǎn)生的現(xiàn)象和結(jié)果。
例 青黛  取本品少量，用微火灼燒，有紫紅色的煙霧產(chǎn)生。又如牛黃  取本品少量，加清水調(diào)和，涂于指甲上，能將指甲染成黃色，習(xí)稱“掛甲”。其他如秦皮（熒光）、車前子（黏液）、菟絲子（吐絲）
2. 顯微鑒別
定義：系指用顯微鏡對(duì)藥材(飲片)切片、粉末、解離組織或表面制片和顯微化學(xué)進(jìn)行鑒別的一種方法。
歷史：顯微鑒別來源于植物解剖學(xué)。我國(guó)生藥顯微鑒別研究始于上世紀(jì)五十年代初，經(jīng)歷了幾十年的研究發(fā)展，特別是近年來顯微鑒定技術(shù)與計(jì)算機(jī)多媒體技術(shù)結(jié)合，
顯微鑒定技術(shù)發(fā)生了質(zhì)的飛躍，顯微特征不再微小、難以掌握；現(xiàn)今顯微鑒別已成為我國(guó)藥典藥材和中成藥鑒別的重要方法之一。
顯微鑒定作為生藥標(biāo)準(zhǔn)：《中國(guó)藥典》、《香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)》、《日本藥局方》、《印度草藥典》、《英國(guó)藥典》、《美國(guó)藥典》、《European Pharmacopoeia》(歐洲藥典) 。
(一)切片標(biāo)本片的制法
1、徒手切片法 材料的預(yù)處理：清洗材料→軟化(堅(jiān)硬材料)
切片：左手拇指和食指夾持材料，中指托住材料，使材料略高出食拇二指，肘關(guān)節(jié)靠在桌沿，材料的切面保持水平。右手執(zhí)刀片，刀口向內(nèi)，并使刀刃與材料的切面平行，移動(dòng)右臂使刀鋒自左前方向右后方向切削。切片過程中經(jīng)常加水，保持濕潤(rùn)。切出的薄片放在盛有蒸餾水或50％乙醇溶液的培養(yǎng)皿中，讓切片展開。
2、滑走切片法 3、冰凍切片法  4、石蠟切片法
(二)粉末標(biāo)本片的制片方法
1、粉末的制備
粉碎機(jī)粉碎：取藥材樣品，清除表面的泥沙和雜質(zhì)，必要時(shí)干燥，切成1～5mm小片，置粉碎機(jī)中粉碎，過60目篩。對(duì)于難以粉碎的纖維，篩出后單獨(dú)粉碎，再混入藥粉中。
乳缽研磨：取藥材樣品，清除表面的泥沙和雜質(zhì)，切成1mm左右的小片，置乳缽中，研磨，即得。
刀片刮?。鹤笫帜粗概c食指握住藥材，右手拿刀片，從藥材表面輕輕刮取粉末。
2、制片
用解剖針挑取少量的粉末，置載玻片中央偏右，加入水合氯醛，用解剖針或玻棒攪勻，加熱，透化，加稀甘油，加蓋玻片，擦拭干凈，即得。
觀察淀粉粒、菊糖、糊粉粒等，用水或稀甘油直接裝片。
(三)表面片的制法
一般葉類中藥材需要制備表面片
整體封片法：對(duì)于很薄的葉子或花冠等，可整體封片。方法為將葉子鋪在玻璃片上，用刀片切取欲觀察的部分，一般4mm見方，一正一反，放在載玻片上。下同切片的制法。
表皮撕離法：將葉子用水浸泡軟化后，左手食指托住葉子，拇指和中指壓住葉子的兩端，右手拿鑷子，撕出葉子的表面，放在水或50％乙醇的培養(yǎng)皿中。以下操作用切片。
(四)解離片的制法
 將藥材切成直徑約2mm、長(zhǎng)約1cm的小條，置試管中，加5％氫氧化鉀溶液適量，在沸水浴中加熱至用玻棒擠壓材料即能離散為止。傾去堿液，材料用水洗滌，取少許材料，置載玻片上，加稀甘油封藏，即成。
(五)顯微化學(xué)反應(yīng)
木化細(xì)胞壁：＋間苯三酚試液→放置2～3min →＋鹽酸→紅色
木栓化或角質(zhì)化細(xì)胞壁：＋蘇丹Ⅲ →放置片刻→桔紅色～紫紅色
淀粉粒：＋碘液→藍(lán)色～紫色
脂肪油、揮發(fā)油、樹脂：＋蘇丹紅→桔紅色～紫紅色
  粘液質(zhì)：＋釕紅→紅色
蛋白質(zhì)和糊粉粒：＋碘液→黃棕色
菊糖：＋α-萘酚→1～2min →＋80％硫酸→紫色而溶解
草酸鈣結(jié)晶：＋稀鹽酸→溶解，無氣泡；＋20％硫酸→ 溶解，無氣泡→ 轉(zhuǎn)變?yōu)獒槧罱Y(jié)晶；＋稀醋酸→不溶解
碳酸鈣結(jié)晶：＋稀鹽酸→溶解，發(fā)生氣泡；＋20％硫酸→ 溶解，發(fā)生氣泡→ 轉(zhuǎn)變?yōu)獒槧罱Y(jié)晶；＋稀醋酸→溶解，發(fā)生氣泡
 3. 一般理化鑒別
    取藥材粉末，用溶劑提取或處理后，制備供試液，再加入規(guī)定的試藥或試液，觀察其顯色或沉淀等反應(yīng)。
(1) 顯色反應(yīng)  (2) 沉淀反應(yīng)  (3) 熒光鑒別
 4. 光譜鑒別
礦物藥的某些光譜特征，可作為鑒別的依據(jù)。
其它藥材、飲片當(dāng)無法建立專屬性鑒別時(shí)，如含有的化學(xué)成分在紫外或可見光區(qū)有特征吸收光譜，也可作為鑒別的依據(jù)。
鑒別特征可采用測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)，如有2～3個(gè)特定吸收波長(zhǎng)時(shí)，可測(cè)定各波長(zhǎng)吸收度的比值。
5. 色譜鑒別
(1) 薄層色譜
(2) 高效液相色譜
特征圖譜
指紋圖譜
(3) 氣相色譜
(4) 毛細(xì)管電色譜
薄層色譜法
  薄層色譜法具有分離與鑒定的雙重功能，通過薄層圖譜與對(duì)照品、對(duì)照藥材的圖譜相比較，除了能鑒別出有效成分或特征成分外，還以完整的色譜圖作為一個(gè)整體對(duì)制劑加以鑒別，提高了鑒別的準(zhǔn)確性，尤其當(dāng)有效成分尚不確切時(shí)，更顯示出薄層色譜法的實(shí)用性。
  鑒于單一化學(xué)對(duì)照品不能反映藥材的整體特征，一些多種植物共存的化學(xué)成分沒有專屬性，以及沒有化學(xué)對(duì)照品鑒別就無法進(jìn)行的問題，從1990版藥典起，薄層色譜鑒別除有化學(xué)對(duì)照品作為鑒別藥材的指標(biāo)成分以外，開始增加了“對(duì)照藥材”，以藥材的色譜整體為特征進(jìn)行對(duì)比鑒別，解決了上述存在的問題。
  薄層色譜分析法適用于微量樣品的分離、鑒定和制備。在中藥制劑制備過程中，經(jīng)適宜的工藝來取舍處方中各藥材的各類成分，從而達(dá)到保持或改變藥物作用性質(zhì)或降低其毒副作用的目的。
        薄層色譜獨(dú)有的特點(diǎn)是分析結(jié)果以直觀的彩色圖像表達(dá)，為其它色譜技術(shù)所不能。而圖像給出的多層面的信息是文字難以表達(dá)的，而且豐富多彩的圖像可以給分析者更多的思考和判斷的空間。
    白芷TLC色譜圖
(上圖樣品未熏硫;下圖樣品被硫熏過)
    陳皮TLC薄層色譜圖
    總之，因TLC法設(shè)備簡(jiǎn)單，分析速度快，分離效率高，結(jié)果直觀，適合我國(guó)國(guó)情，能有效、直觀地反映藥品的真實(shí)性、穩(wěn)定性，現(xiàn)已成為中藥制劑的鑒別和質(zhì)量控制的行之有效的方法之一，很快被用作定性和半定量的方法。
   -2005年版收載薄層色譜鑒別1507項(xiàng)
   -2010年版新增薄層色譜鑒別2494項(xiàng)
技術(shù)要求
（1）在建立方法時(shí)，盡量采用以對(duì)照品和對(duì)照藥材或?qū)φ仗崛∥锿瑫r(shí)進(jìn)行對(duì)照。當(dāng)對(duì)照品不易獲得時(shí)，采用以對(duì)照藥材為對(duì)照；某些鑒別被測(cè)物為單一成分的，可以只采用對(duì)照品進(jìn)行對(duì)照；不宜采用Rf值表述色譜行為。
（2）供試品溶液的制備應(yīng)盡可能除去干擾色譜的雜質(zhì)，同時(shí)方法要盡量簡(jiǎn)便，應(yīng)視被測(cè)物的特性來選擇適宜的溶劑和方法進(jìn)行提取、分離。
（3） 為了使圖譜清晰，斑點(diǎn)明顯，分離度與重現(xiàn)性符合要求，應(yīng)根據(jù)被測(cè)物的特性選擇合適的固定相、展開劑及顯色方法等色譜條件。確定供試品取樣量、提取和純化方法、點(diǎn)樣量等條件；選擇合適的對(duì)照物質(zhì)，確定對(duì)照物質(zhì)用量、濃度、溶劑、點(diǎn)樣量等。
（4）由于實(shí)驗(yàn)時(shí)的溫度、濕度常會(huì)影響薄層色譜結(jié)果，因此，建立方法時(shí)應(yīng)對(duì)上述因素進(jìn)行考察。如有必要，應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)正文中注明溫、濕度要求。
（5）除需要改性，一般應(yīng)采用預(yù)制的商品薄層板。不同品牌的薄層板或自制薄層板的薄層色譜結(jié)果有一定的差異，因此應(yīng)對(duì)其進(jìn)行考察選擇適宜的薄層板。
    白芷
RADIX ANGELICAE DAHURICAE
   ←異歐前胡素
   6. 生物鑒別
  (1) DNA鑒別
  DNA分子鑒定技術(shù)
 DNA分子鑒定技術(shù)是利用一種分子生物引物，引導(dǎo)DNA聚合酶在引物識(shí)別位點(diǎn)之間兩條互補(bǔ)鏈上進(jìn)行DNA合成，經(jīng)過模板變形、引物復(fù)性及引物延伸三步反應(yīng)的多次循環(huán)，可使特定DNA片段呈指數(shù)增加，即使待測(cè)品只有微量DNA 分子，都可充分?jǐn)U增至數(shù)百個(gè)分子供鑒別和測(cè)定。
DNA分子鑒定技術(shù)
首次用于中藥標(biāo)準(zhǔn)中
新版藥典對(duì)于蛇類藥材物種鑒定采用了DNA分子鑒定技術(shù)
研究采用了試劑盒使操作時(shí)間大大縮短，精度提高
該方法的采用有力的遏制了困擾市場(chǎng)和監(jiān)督多年的假冒偽品問題。
 【鑒別】  聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(PCR)
 模板DNA提取  取本品粉末約0.5g，液氮中充分研磨使成粉末，取適量（約0.1g）至1.5mL離心管中，加入275μl消化液（細(xì)胞核裂解液200 μl，0.5M EDTA 50μl，蛋白酶K（20mg/ml）20μl，RNA酶溶液 5μl），55℃溫育1小時(shí)，入250μl Wizard SV Lysis Buffer混勻，加到柱中，10000r/min離心3分鐘；棄掉過濾液，加入800μl洗脫液（醋酸鉀162.8mM，Tris-HCl 22.6mM（pH7.5），EDTA 0.019mM（pH8.0），60% 乙醇），10000r/min離心1分鐘；棄掉過濾液，用洗脫液反復(fù)洗脫3次，每次10000r/min離心1分鐘；棄掉最后一次過濾液后再離心2分鐘，將過濾柱轉(zhuǎn)移入新的離心管中，加入100μl無菌雙蒸水，室溫放置2分鐘后，10000r/min離心2分鐘，濾液-20℃保存?zhèn)溆?。取?duì)照藥材粉末約0.5g，同法制成對(duì)照藥材模板DNA溶液。
 
   PCR反應(yīng)  鑒別引物：5’GGCAATTCACTACACAGCCAACATCAACT3’和5’CCATAGTCAGGTGGTTAGTGATAC3’。PCR反應(yīng)體系：25μl反應(yīng)體系包括10×PCR緩沖液2.5μl，dNTP（2.5mM）2μl，鑒別引物（10μM）各0.5μl，高保真Taq DNA聚合酶（5U./ μl）0.2μl，模板0.5μl，無菌雙蒸水19.3μl。PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性5分鐘后，進(jìn)行30次循環(huán)（95℃ 30秒，63℃ 45秒），后延伸72℃ 5分鐘。
 電泳檢測(cè)  用瓊脂糖凝膠電泳法，膠濃度為1％，膠中加入核酸凝膠染色劑GelRed；供試品與對(duì)照藥材鑒別PCR產(chǎn)物的上樣量分別為8μl，DNA分子量標(biāo)記上樣量為2μl（0.5μg/μl）。電泳結(jié)束后，凝膠在凝膠成像儀上或紫外透射儀上觀察，供試品與對(duì)照藥材凝膠電泳圖譜在300-400bp之間應(yīng)有單一條帶。
 供試品凝膠電泳圖譜中，在300-400bp之間應(yīng)有單一條帶。
烏梢蛇PCR分子鑒定
酒烏梢蛇PCR分子鑒定
薄層-生物自顯影技術(shù)
     TLC生物自顯影是一種將薄層色譜分離和生物活性測(cè)定相結(jié)合的藥物篩選方法,具有操作簡(jiǎn)單、耗費(fèi)低、靈敏度和專屬性高等優(yōu)點(diǎn),是一種快速測(cè)定生物活性的方法.可用于對(duì)具有抗菌/真菌,抑制膽堿酯酶以及清除自由基和抗氧化等活性的天然產(chǎn)物的篩選,可實(shí)現(xiàn)活性指導(dǎo)的提取分離.利用TLC生物自顯影,可測(cè)定單體活性化合物的最小抑制濃度(MID),通過與對(duì)照品的MID值比較,能夠推測(cè)該化合物活性的強(qiáng)弱.此外,利用TLC生物自顯影定性及定量的特征,還可對(duì)食物、水樣及動(dòng)物組織中抗生素殘留量進(jìn)行監(jiān)測(cè).
薄層-生物自顯影技術(shù)
和生物活性測(cè)定相結(jié)合
使薄層色譜分離得到的結(jié)果，除了鑒別真?zhèn)沃?，還能知道其中哪些成分有生物活性。
新版藥典在生地黃、熟地黃等標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)用。
1、DPPH 自由基清除活性
特征與指紋圖譜
  特征和指紋圖譜本質(zhì)上是藥典色譜技術(shù)在應(yīng)用上的延伸；確能夠反映中藥內(nèi)在質(zhì)量的整體變化情況和質(zhì)量的均一程度；控制產(chǎn)品批與批間的穩(wěn)定切實(shí)可行。2005版收載高效液相色譜特征圖譜1項(xiàng)，2010版收載高效液相色譜特征圖譜11項(xiàng)，指紋圖譜11項(xiàng)。使整體性控制中藥質(zhì)量的方法學(xué)和實(shí)際應(yīng)用方面有了大幅度的提高，確保中藥質(zhì)量的均一穩(wěn)定。
例:茵陳的特征圖譜
 【特征圖譜】 照高效液相色譜法（附錄VI D）測(cè)定。
 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)  以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑......
 參照物溶液的制備  取綠原酸對(duì)照品適量，精密稱定,加60%甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。
 供試品溶液的制備  取對(duì)羥基苯乙酮含量測(cè)定項(xiàng)下供試品溶液，即得。
 測(cè)定法  分別精密吸取參照物和供試品溶液各5μl，注入液相色譜儀，測(cè)定。
 
供試品特征圖譜中應(yīng)有7個(gè)特征峰，與參照物相應(yīng)的峰為S峰，計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±5%之內(nèi)。規(guī)定值為0.509（峰1）、0.627（峰2）、1.000（峰S）、1.109（峰3）、2.045（峰4）、2.075（峰5）、2.367（峰6）.
檢查
   “檢查”系指對(duì)藥材及飲片的純凈程度、可溶性物質(zhì)、有害或有毒物質(zhì)進(jìn)行的限量檢查，如水分、灰分、雜質(zhì)、毒性成分、重金屬及有害元素、農(nóng)藥殘留、黃曲霉毒素、二氧化硫等。
    雜質(zhì)檢查通常應(yīng)進(jìn)行全量測(cè)試；然后將雜質(zhì)混入樣品中，一并隨機(jī)抽取足量樣品粉碎后進(jìn)行其他項(xiàng)目檢驗(yàn)。
    除另有規(guī)定，飲片水分通常不得過13%；藥屑雜質(zhì)通常不得過3%。起草標(biāo)準(zhǔn)時(shí)當(dāng)總灰分超過15%時(shí)不收入藥典。
黃曲霉毒素測(cè)定法
 2010年版藥典首次在附錄中新增黃曲霉毒素測(cè)定法、對(duì)易霉變的桃仁、酸棗仁、陳皮、胖大海、僵蠶等5種規(guī)定黃曲霉毒素測(cè)定，并規(guī)定每1000g含黃曲霉毒素B1不得過5μg，含黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素B2和黃曲霉毒素B1的總量不得過10μg。
 
黃曲霉毒素測(cè)定
  黃曲霉毒素（AFT）是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的化合物，均為二氫呋喃香豆素的衍生物。黃曲霉毒素是主要由黃曲霉(aspergillus flavus) 寄生曲霉 (a.parasiticus) 產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，在濕熱地區(qū)食品和飼料中出現(xiàn)黃曲霉毒素的機(jī)率最高。
 
   1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為1類致癌物,是一種毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì).黃曲霉毒素的危害性在于對(duì)人及動(dòng)物肝臟組織有破壞作用,嚴(yán)重時(shí),可導(dǎo)致肝癌甚至死亡.在天然污染的食品中以黃曲霉毒素B1最為多見,其毒性和致癌性也最強(qiáng).
    黃曲霉毒素Bl的半數(shù)致死量為0.36毫克/公斤體重,屬特劇毒的毒物范圍(動(dòng)物半數(shù)致死量<10毫克/公斤=它的毒性比氰化鉀大10倍,比砒霜大68倍).它引起人的中毒主要是損害肝臟,發(fā)生肝炎,肝硬化, 肝壞死等.臨床表現(xiàn)有胃部不適,食欲減退,惡心,嘔吐,腹脹及肝區(qū)觸痛等;嚴(yán)重者出現(xiàn)水腫,昏迷,以至抽搐而死.黃曲霉毒素是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的致癌物質(zhì).其致癌力是奶油黃的900倍,比二甲基亞硝胺誘發(fā)肝癌的能力大75倍,比3,4苯并芘大4000倍.它主要誘使動(dòng)物發(fā)生肝癌,也能誘發(fā)胃癌,腎癌,直腸癌及乳腺,卵巢,小腸等部位的癌癥.
   B1是最危險(xiǎn)的致癌物，經(jīng)常在玉米，花生，棉花種子，一些干果中常能檢測(cè)到。它們?cè)谧贤饩€照射下能產(chǎn)生熒光，根據(jù)熒光顏色不同，將其分為B族和G族兩大類及其衍生物。AFT目前已發(fā)現(xiàn)20余種。AFT主要污染糧油食品、動(dòng)植物食品、部分中藥材等。其中以花生和玉米污染最嚴(yán)重。家庭自制發(fā)酵食品也能檢出黃曲霉毒素，尤其是高溫高濕地區(qū)的糧油及制品種撿出率更高。
黃曲霉毒素
黃曲霉毒素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的研究
桃仁（黃曲霉毒素）
 
 【檢查】 黃曲霉毒素  照黃曲霉毒素測(cè)定法（附錄Ⅸ V）測(cè)定。
 供試品溶液的制備  取本品粉末（過二號(hào)篩）5g，精密稱定，加入3g氯化鈉， 70%甲醇75ml，高速攪拌2分鐘（攪拌速度大于11，000轉(zhuǎn)/分），離心5分鐘（離心速度2500轉(zhuǎn)/分），精密吸取上清液10ml，用水稀釋至50ml，搖勻，離心5分鐘，上清液用玻璃纖維濾紙濾過，取續(xù)濾液20ml，通過免疫親合柱（流速3ml/min.），隨后用水20ml洗脫（流速6ml/min.），洗脫液棄去，再用1.5ml甲醇洗脫（流速1ml/min.），收集甲醇洗脫液，用水稀釋至2ml，搖勻，即得。
 本品每1000g含黃曲霉毒素B1不得過5µg，含黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素B2和黃曲霉毒素B1的總量不得過10µg。
 中藥材中二氧化硫殘留
  1.亞硫酸鹽對(duì)人體健康的影響
    中藥材經(jīng)硫磺熏蒸后，在這個(gè)處理過程中單質(zhì)硫生成二氧化硫與中藥材中無機(jī)元素生成亞硫酸鹽。亞硫酸鹽因其具有還原作用，可阻斷微生物的正常生理氧化過程。因而可以抑制微生物繁殖，可抑制水果中氧化酶的活力，防止氧化酶對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的破壞和顏色的改變。故中藥材長(zhǎng)期以來被用硫磺熏蒸，用于藥材的漂白、脫色、抗氧化和防腐。是有一定的科學(xué)依據(jù)，但尚若硫磺熏蒸操作隨意、無序過量使用，人體在攝入過多亞硫酸鹽時(shí)對(duì)腸胃、肝臟有損害，使紅血球紅蛋白減少。
 以白芍為例：中檢所曾檢測(cè)10批藥材,其中一批最高的二氧化硫殘留是2998mg/kg，最低的一批為0.0688mg/kg兩批相差5-6個(gè)數(shù)量級(jí).
  以板藍(lán)根為例:檢測(cè)10批樣品,最高可達(dá)1967mg/kg最低0.0292 mg/kg，其中6批未檢出二氧化硫殘留。說明10批樣品中有四批被硫磺熏蒸過，其它6批未被硫磺熏蒸。板藍(lán)根藥材傳統(tǒng)上不熏蒸，檢出二氧化硫殘留可能是商家為使藥材外觀顏色好看，以次充好。
   
二氧化硫殘留的測(cè)定方法
1.比色法和蒸餾法
  食品中亞硫酸鹽（亞硫酸鹽以二氧化硫計(jì)）的測(cè)定,通行的方法是第一法鹽酸付玫瑰苯胺法和第二法蒸餾法。第一法鹽酸付玫瑰苯胺比色法是四氯汞鈉吸收，而吸收液中汞的殘留高，使用后廢液處理不當(dāng)，對(duì)環(huán)境造成新的污染。第二法蒸餾法為經(jīng)典的方法其簡(jiǎn)便、靈敏、快速易于普及。(GB/T5009.34-2003)
    二氧化硫殘留的測(cè)定方法
  2.離子色譜法
 離子色譜儀器性能先進(jìn)，選擇性強(qiáng)。但儀器較昂貴，目前尚未普及、涉及中藥材，應(yīng)用的分析領(lǐng)域較窄。針對(duì)中藥材中的二氧化硫殘留測(cè)定僅在做一些實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)研究工作。

A  為兩頸蒸餾瓶1000ML；B為豎式冷凝器 固定在兩頸蒸餾瓶A上；
C 為（帶刻度）分液漏斗固定在兩頸蒸餾瓶A上；D 連接氮?dú)饬魅肟冢?BR>E  為連接二氧化硫氣體至吸收液入口；
二氧化硫殘留量
  中藥材及飲片（礦物來源的中藥材除外）中亞硫酸鹽殘留量(以二氧化硫計(jì)）不得過150mg/kg，山藥、牛膝、粉葛、天冬、天麻、天花粉、白及、白芍、白術(shù)、黨參等10種中藥材及其飲片中亞硫酸鹽殘留量(以二氧化硫計(jì)）不得過400mg/kg。已收載進(jìn)2010年版《中國(guó)藥典》第二增補(bǔ)本。
   藥材飲片檢測(cè)項(xiàng)目概況
重金屬檢查
石膏、白礬、玄明粉、地龍、芒硝、西瓜霜、龜甲膠、
冰片、鹿角膠、滑石粉等32種藥材及成藥。
砷鹽檢查
石膏、白礬、玄明粉、地龍、芒硝、冰片等15種。
重金屬及有害元素
山楂、丹參、甘草、白芍、西洋參、阿膠、金銀花、枸杞子、黃芪等17種（對(duì)用藥時(shí)間較長(zhǎng)、或兒童常用藥品增加重金屬和有害元素檢查）。
有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量
甘草、黃芪、人參莖葉總皂苷、人參總皂苷。
黃曲霉毒素檢查
陳皮、胖大海、桃仁、酸棗仁、僵蠶
樹脂殘留溶劑檢查
三七三醇皂苷、三七皂苷、燈盞花素
特殊雜質(zhì)檢查
大黃（土大黃苷）、西洋參（人參）等
含量測(cè)定
1. 含量測(cè)定成分的確定
首選有效或活性成分，如含有多種活性成分，應(yīng)盡可能選擇與中醫(yī)用藥功能與主治相關(guān)成分。
為了更全面控制質(zhì)量，可以采用同一方法測(cè)定2個(gè)以上多成分含量，一般以總量計(jì)制訂含量限度為宜。
對(duì)于尚無法建立有效成分含量測(cè)定，或雖已建立含量測(cè)定，但所測(cè)定成分與功效相關(guān)性差或含量低的藥材和飲片，而其有效成分類別又清楚的，可進(jìn)行有效類別成分的測(cè)定，如總黃酮、總生物堿、總皂苷、總鞣質(zhì)等的測(cè)定；
含揮發(fā)油成分的，可測(cè)定揮發(fā)油含量。
某些品種，除檢測(cè)單一專屬性成分外，還可測(cè)定其他類別成分，如五倍子測(cè)定沒食子酸及鞣質(zhì)；姜黃測(cè)定姜黃素及揮發(fā)油含量等。
應(yīng)選擇測(cè)定原形成分，不宜選擇測(cè)定水解成分。
不宜采用無專屬性的指標(biāo)成分和微量成分（含量低于萬分之二的成分）定量。
2. 含量測(cè)定方法
(1) 重量法
(2) 容量法
(3) 紫外-可見分光光度法
(4) 高效液相色譜法
(5) 氣相色譜法
(6) 毛細(xì)管電色譜法
(7) 薄層色譜掃描法
(8) 生物測(cè)定法
2. 含量測(cè)定方法的確定
  含量測(cè)定方法應(yīng)具有專屬性，如測(cè)定方法無法做到專屬性而采用了某一種非專屬性的方法，則應(yīng)用其他的分析方法來達(dá)到總體的專屬性。比如，可附加一種合適的鑒別試驗(yàn)（如特征或指紋圖譜等）。
選用的分析方法應(yīng)符合“中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”的要求。
 3.供試品溶液制備方法選擇
（1）提取條件的確定,應(yīng)對(duì)不同溶劑、不同提取方式、不同時(shí)間及不同溫度等條件進(jìn)行比較，確定最佳條件，并提供研究數(shù)據(jù)。
（2）分離純化條件的確定，根據(jù)被測(cè)成分的性質(zhì)，對(duì)樣品溶液可進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆蛛x純化以排除干擾物質(zhì)，如采用液-液萃取及聚酰胺、氧化鋁、硅膠、大孔吸附樹脂等色譜純化方法，并提供方法選擇的依據(jù)及相應(yīng)的研究數(shù)據(jù)。
3. 含量測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證
按現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》附錄收載的“中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”的要求進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。
準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)，其回收率應(yīng)在95%～105%范圍內(nèi)，其中對(duì)于一些前處理較復(fù)雜的方法，其回收率可在90%～110%范圍內(nèi)；RSD應(yīng)小于5%；
精密度實(shí)驗(yàn)的RSD應(yīng)小于3% 。
線性范圍
耐用性
 含量測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證
準(zhǔn)確度 (accuracy)
回收率 (recovery)
提取率(extraction efficiency)
分離度(resolution）－峰純度、對(duì)稱性、與相鄰峰的分離度
響應(yīng)(response)
精密度 (precision)
重復(fù)性 (repeatability)
再現(xiàn)性 (reproducibility)
分離度
指標(biāo)成分色譜的分離度直接影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。
重點(diǎn)考察色譜蜂或斑點(diǎn)的純度
對(duì)稱性
峰寬
LC-MS
峰形不對(duì)稱、過寬也會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確
重復(fù)性與再現(xiàn)性
重復(fù)性：同一個(gè)操作者對(duì)同批次樣品進(jìn)行重復(fù)取樣分析  
再現(xiàn)性：不同的操作者在不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相同批次樣品的分析—Intra-labs validation
關(guān)鍵影響因素
樣品的均勻度
對(duì)照品的均勻度－不同批次的對(duì)照品純度或晶型的不同會(huì)對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生很大影響！
經(jīng)驗(yàn)：把結(jié)晶研成粉末，混勻后分裝可避免對(duì)照品的不均勻。
耐受性試驗(yàn)
（ruggedness and robustness test)
分離介質(zhì)（色譜柱、薄層板，等）
溶媒的生產(chǎn)廠家、批號(hào)
實(shí)驗(yàn)環(huán)境：溫度、濕度
儀器設(shè)備
操作人員
保留時(shí)間（Rf值）的允許波動(dòng)范圍
準(zhǔn)確度
提取率：避免被回收率的表面現(xiàn)象所蒙蔽
用選定的溶劑進(jìn)行連續(xù)或多次回流提取，比較相鄰兩次提取的差異，或用多次提取的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來標(biāo)示。
用回流提取的最大提取率與超聲提取法進(jìn)行比較；
多次超聲，進(jìn)行提取率的比較
4. 含量限幅度的制定
應(yīng)根據(jù)藥材、飲片的實(shí)際情況來制定含量限(幅)度。一般應(yīng)根據(jù)不低于10批樣品的測(cè)定數(shù)據(jù)，按其平均值的±20％作為限度的制定幅度，以干燥品來計(jì)算含量；
毒性藥材、飲片要制定限度范圍，根據(jù)毒理學(xué)研究結(jié)果及中醫(yī)臨床常用劑量，確定合理的上下限數(shù)值。
含量限度規(guī)定的方式，有以下幾種：
所測(cè)定成分為有效成分時(shí)可只規(guī)定下限。所測(cè)定成分為有毒成分時(shí)可作限量檢查，只規(guī)定上限。
所測(cè)定成分為有毒成分同時(shí)又為有效成分時(shí)必須規(guī)定幅度。
凡含有兩種以上的有效成分，而且該類成分屬于相互轉(zhuǎn)化的，可規(guī)定二種成分之和。
多植物來源的藥材、飲片，如外形能區(qū)分開而其含量差異又較大者，可制訂兩個(gè)指標(biāo)。
關(guān)鍵：藥材、飲片的代表性！
【注意】 進(jìn)行測(cè)定時(shí)，需要粉碎的藥材和飲片，應(yīng)按各正文標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下規(guī)定的要求粉碎過篩，并注意混合均勻。樣品粉碎通常在理化檢測(cè)前，現(xiàn)用現(xiàn)粉碎。尤其測(cè)定含揮發(fā)性物質(zhì)、易氧化、光不穩(wěn)定成分。粉碎時(shí)應(yīng)使全部樣品通過規(guī)定藥篩，但不宜比規(guī)定粒度太細(xì)，否則易糊化或形成微球阻礙成分溶出。
中藥材、飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)發(fā)展思路
(一) 進(jìn)一步加強(qiáng)中藥材有效成分研究，為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定奠定物質(zhì)基礎(chǔ)
(二) 推廣以對(duì)照提取物為對(duì)照的藥材、飲片TLC鑒別
優(yōu)勢(shì)：
多成分對(duì)照，專屬性強(qiáng)
大批量生產(chǎn)，一致性、均一性強(qiáng)，成本低
微量化、芯片化，攜帶、使用方便，成本更低
說明書附TLC圖片，鑒定更加準(zhǔn)確、明了
(三) 建立基于“特征圖譜”的藥材、飲片質(zhì)量控制方法
鑒別：專屬性強(qiáng)
品質(zhì)評(píng)價(jià)：半定量
(四) 推廣以標(biāo)化提取物為對(duì)照的藥材、飲片多成分含量測(cè)定
制備簡(jiǎn)單，成本低
定量化包裝，使用方便
節(jié)省對(duì)照品
說明書附色譜圖，色譜峰易于鑒別
(五) 進(jìn)一步探索建立基于“一標(biāo)多測(cè)”方法的藥材、飲片多成分含量測(cè)定
“一標(biāo)多測(cè)”定義：采用一種化學(xué)對(duì)照品測(cè)定多種化學(xué)成分的含量，簡(jiǎn)稱“一標(biāo)多測(cè)”。 One single standard substance for the determination of multiple components (One for M)。
實(shí)際上是一種內(nèi)標(biāo)的方法，在國(guó)際上已用于植物藥、食品、果酒等的多成分含量測(cè)定。
 研究方法：
方法學(xué)研究
計(jì)算測(cè)定化合物與對(duì)照品之間的校正因子(F)
優(yōu)勢(shì)：解決對(duì)照品缺乏問題；節(jié)省對(duì)照品；節(jié)省測(cè)定時(shí)間
(六) 繼續(xù)探索建立中藥生物測(cè)定法
方法準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性
測(cè)定周期
操作難度
檢測(cè)費(fèi)用
與功能主治的相關(guān)性
(七) 進(jìn)一步完善中藥材（飲片）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及其評(píng)價(jià)體系
中藥材、飲片質(zhì)量評(píng)價(jià)體系
(八) 建立中藥材（飲片）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫及其信息平臺(tái)

（河南省食品藥品檢驗(yàn)所  李振國(guó)）